E. S. P. O. CH
ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
Aldaz Alex alexchristopheraldaztoala@gmail.com
6to Semestre
RIOBAMBA – ECUADOR
TEMA:
HIDRÓLISIS DE UNA PROTEÍNA - CROMATOGRAFÍA EN PAPEL DE AMINOÁCIDOS
2. OBJETIVOS:
2.1 General:
- Realizar la hidrólisis de una proteína, mediante acidificación para una respectiva cromatografía ascendente.
2.2 Específicos:
- Emplear la técnica de cromatografía en papel para separar y aislar aminoácidos.
- Conocer la técnica de una cromatografía ascendente en papel.
- Hidrolizar el gluten de trigo para la identificación de los aminoácidos presentes en el mismo.
- Calcular los valores de Rf de las sustancias empleadas (aminoácidos).
3. MARCO TEÓRICO
Introducción:
La cromatografía en papel es un tipo de Cromatografía de Reparto, en donde los componentes de una mezcla se separan en base a una distribución diferente entre la fase móvil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las moléculas a lo largo del sistema cromatográfico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisión o arrastre ejercido por la fase móvil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorción. La teoría de la cromatografía de reparto se basa en que, en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en contacto una con otra y si una de las dos fases contiene un soluto, éste se distribuirá entre ambas de acuerdo con sus solubilidades relativas. Dicho fenómeno se denomina reparto.
En la cromatografía de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almidón, celulosa, gel de sílice, óxido de aluminio, etcétera. Aunque en teoría se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorción, por lo que la separación ocurrirá también, en parte, debido a la interacción entre las moléculas a separar con dicho soporte, la cual actuaría como fuerza de frenado.
Tanto la cromatografía en papel como su análoga en capa fina están comprendidas en la descripción de Cromatografía en Dos Dimensiones, debido a las dos dimensiones espaciales que son el ancho y el largo que son características de una Cromatografía en Plano.
Fundamento:
El uso de la cromatografía en papel para la separación e identificación de aminoácidos es de gran importancia desde que fue introducida por Martin en 1944, la fase móvil empleada generalmente es una mezcla de n‐butanol/ácido acético/agua o dilución acuosa de fenol (polar y ácida), estas combinaciones de fases móviles poseen densidad mayor que otros sistemas de solventes y requiere de por lo menos de 2 a 3 horas para que el frente del solvente alcance una distancia prudente en una placa relativamente larga.
Sin embargo en un experimento descrito por Gabriel 2 en 1968 se estudió la alternativa de emplear acetonitrilo y un buffer (polar y ácida o alcalina dependiendo el pH del buffer) obteniéndose buenos resultados en el tiempo de desarrollo (40 minutos) sin necesidad de que se reequilibre el papel. Si bien, el empleo de acetonitrilo reduce el tiempo experimental, este incrementa la toxicidad y por lo tanto deben emplearse las medidas pertinentes.
El empleo de las soluciones tampón o buffer se asocia a que las características químicas de los aminoácidos cambian con el valor de potencial de hidrógeno de trabajo, de esta manera estos pueden desplazarse más cuando las condiciones de la fase móvil (cuyo efecto es predominante) así se lo permiten. Lo anteriormente expuesto ilustra cómo los procesos cromatográficos tanto instrumentales como no instrumentales (en cualquiera de sus variantes) son receptivos a nuevas alternativas metodológicas y continuamente sufren cambios que beneficien en aspectos como resolución, separación, empleo de recursos y tiempo por mencionar algunos.
Figura (1): identificacion de aminoacidos en papel cromatográfico (b), y determinación del espacio recorrido en forma ascendente de los aminoácidos por el solvente.
Para calcular el Rf, se aplica la siguiente relación:
El Rf es una constante característica de cada compuesto, siempre y cuando la determinación se efectúe bajo las mismas condiciones. El RF se define como la distancia recorrida por un compuesto desde su origen hasta su porción final, dividida entre la distancia recorrida por el eluyente desde el origen de la mezcla hasta la altura máxima alcanzada por el frente de dicho solvente.
4. PROCEDIMIENTO
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 RESULTADOS
5.1.1 Resultado Práctico
Figura (2)
En la figura se observa la presencia del ácido aspártico, fenilalanina, hidrolizado de gluten, tirosina y triptófano.
5.1.2 Resultado del Cálculo
- Para la muestra acido aspartico:
Rf= x/y
Rf= 2.5/13.5
Rf= 0.185
- Para la muestra de fenilalanina :
Rf= x/y
Rf= 7.5/13.5
Rf= 0.56
- Para la muestra de hidrolizado de gluten :
Rf= x/y
Rf= 6/13.5
Rf= 0.44
- Para la muestra de tirosina :
Rf= x/y
Rf= 3.8/13.5
Rf= 0.28
- Para la muestra de triptófano :
Rf= x/y
Rf= 6.8/13.5
Rf= 0.50
5.2 DISCUSIÓN
A lo largo de la práctica de cromatografía ascendente de aminoácidos en papel, se logró la identificación de los distintos aminoácidos tales como el ácido aspártico, la fenilalanina, el hidrolizado del gluten, la tirosina y el triptófano a partir de la hidrólisis de proteínas además de identificarlos a través de su factor de retención (Rf) 0.185; 0.56; 0.43; 0.28 y 0.52. respectivamente. Evidenciando así la separación de los mismos.
La coloración que se evidencia en el papel es de acuerdo al aminoácido que fue hidrolizado. Es importante saber que las manchas de las muestras que se dan después de revelarlo.
6. CONCLUSIÓN
- La cromatografía ascendente en papel es una técnica que mediante la ayuda de un solvente permite separar diferentes sustancias en este caso aminoácidos gracias a su diferencia en los factores de retención.
- Llevada a cabo esta práctica se pudo comprender que la cromatografía ascendente en papel, es una técnica de separación muy versátil; a sapiencia de que el flujo de la fase móvil es producido por capilares. Además de ello presenta características tales como: Es sencilla, rápida y principalmente no requiere el uso de aparatos complicados.
- Así mismo con la cromatografía se pudo realizar la separación de los aminoácidos del gluten preparado, al colocarlos en el papel con el solvente ya previsto en la cuba. De lo cual el gluten al representar más del 70% de proteínas en el trigo; al hidrolizarse se obtienen péptidos bioactivos que al reaccionar con el solvente de la cuba manifiestan una coloración diferente para cada aminoácido presente en el papel.
- Se pudo determinar el valor de los rf tanto para el triptófano como el hidrolizado de gluten; resultando los siguientes: (0.50) y (0.44), respectivamente. Siendo el primero el valor que más se acerca al rf del hidrolizado de gluten.
7. BIBLIOGRAFÍA
Marco Teórico
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